常見微生物標準菌種衰退原因及預防

　　一、菌種衰退原因

　　菌種衰退的根本原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發生負突變，則表現為產量下降；如果控制孢子生成的基因發生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發生自發突變。雖然自發突變的幾率很低(一般為10-6～10-9)，尤其是對于某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由于微生物具有*的代謝繁殖能力，隨著傳代次數增加，衰退細胞的數目就會不斷增加，在數量上逐漸占優勢，成為一株衰退了的菌株。此外，菌種衰退還有以下幾種原因：

　　1、表型延遲造成菌種衰退

　　表型延遲現象也會造成菌種衰退。如，在誘變育種過程中，經常會發現某菌株初篩時產量較高，進行復篩時產量卻下降了。

　　2、質粒脫落導致菌種衰退

　　質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控制的。當菌株細胞由于自發突變或外界條件影響(如高溫)，致使控制產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒復制不一致，即DNA復制速度超過質粒，經多次傳代后，某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒，這類細胞數量不斷提高達到優勢，則菌種表現為衰退。

　　3、連續傳代

　　連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面，傳代次數越多，發生自發突變(尤其是負突變)的幾率越高；另一方面，傳代次數越多，群體中個別的衰退型細胞數量增加并占據優勢越快，致使群體表型出現衰退。

　　4、不適宜的培養和保藏條件

　　不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養條件如營養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發衰退型細胞的出現，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。

　　二、防止菌種衰退措施

　　采用已衰退菌種進行生產會影響生產效率，而把已衰退菌種作為陽性菌株進行檢驗，則會影響檢驗正確率。既然變異是不可避免的，那么我們應該如果避免菌種衰退呢？

　　1、控制傳代次數

　　盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代減少到低的水平以減少突變幾率。傳代次數越多，產生突變的幾率就越大，菌種發生衰退的機會就越高。在實驗室檢驗或者是生產實際中，應嚴格控制傳代次數。中國藥典當中規定，培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代，以防止菌株因傳代次數過多引起衰退影響檢驗。

　　2、利用不同類型細胞進行接種傳代

　　放線菌，霉菌用菌絲進行移種比分生孢子容易衰退，因菌絲是對核且有異核存在，所以移種霉菌適宜采用孢子。

　　3、良好的培養條件

　　不良的培養條件會衰退細胞的出現，因此采用適宜的培養基進行菌種培養，以減少衰退幾率

　　4、采用有效的菌種保藏方法

　　根據保存時間的長短，選擇適宜的保存方法。

　　傳代培養法：復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養。保藏時間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉一次，普通細菌1個月轉一次，假單胞菌2周轉一次

　　甘油凍存法：將復活后經過性能確認的菌株新鮮培養物（一般是第二代菌株），用0.85%的滅菌生理鹽水（約1-2ml）洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管（凍存管）中（如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌液），加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。

　　瓷珠保存管保存：菌株保藏管內含特制的小珠（20-25顆）和特殊溶液，只需將培養好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

　　瓷珠保存管保存具體操作：

　　第一步：對需要保存的菌株進行必要的純化，挑取生長旺盛時期的菌落，接入菌株保藏管中，通常需要接入4-7環，對于苛養菌應多接一些；

　　第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；

　　第三步：用無菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；

　　第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存（推薦使用-70℃超低溫冰箱）；

　　第五步：復蘇時，只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養。